2021-4-9 | 医学
我国是世界上最大的蛋品生产国，但目前蛋品加工水平却较低、技术陈旧，同时由于某些饮食习惯和行业的特殊需求，对蛋黄的需求量较大，比如做月饼、蛋黄派等，其副产物——蛋清常被低值利用甚至被当成废弃物丢弃，也污染了环境[1]。蛋清蛋白是食物中最理想的优质蛋白质，其氨基酸组成非常适合人体需要，利用率高达99.6%，但由于其受热易凝固等性质也使其应用受到了一定程度的限制[2]。而将其酶法改性后却能得到具有多种生理活性的蛋清肽(eggwhitepeptides，EWP)，使其附加值大大提高。钙是人体必需的常量元素，参与机体多种生理活动。人类缺钙是全球性的营养问题，可导致人体产生骨质疏松、佝偻症等多种疾病，甚至对心血管也会产生极大的负作用，然而人们却一直找不到有效、经济的钙源补充[3]。小肽能与钙离子形成可溶性螯合物，完整地被转运吸收，需要时又能有效地将钙离子释放出来，同时还能补充一定的氨基酸[4]。与其他补钙剂相比，它更易被快速吸收，稳定性更好。
国内外已有不少学者研究了肽-钙配合物、氨基酸-钙螯合物的补钙作用。Choi等[5]研究了卵黄高磷蛋白磷酸肽的钙结合能力，实验组的饲料中加入0.125%～0.5%卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙配合物，结果发现实验组的SD大鼠的骨密度和骨矿物质含量较空白组显著提高，表明卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙配合物能够有效提高钙的生物利用率，促进钙质沉积于骨骼。菅景颖[6]对胶原多肽-钙配合物的研究表明，其无论是在对骨质疏松的治疗和预防，还是在促进骨骼生长和壮骨方面，效果均十分理想，效果优于葡萄糖酸钙和CaCO3。但目前尚未见有研究蛋清肽-钙配合物(EWP-Ca)补钙功能的报道。本实验首次对EWP-Ca促钙吸收功能进行研究，通过在最优条件下制得的EWP-Ca，饲喂缺钙大鼠一个月，研究该配合物对处于生长期的大鼠的骨骼发育的影响，为该产品在今后进一步用于人体补钙提供一定的依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
Wistar大鼠，雄性，SPF级，体质量(80±5)g，购自湖北省疾病预防控制中心,许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。按照文献[7]的方法制备EWP-Ca，再经截留分子质量为5kD的超滤膜处理，收集膜透过级分，冻干，其钙结合率为16.45%。CaCO3(优级纯)国药集团化学试剂有限公司；血清钙试剂盒、血清磷试剂盒、血清碱性磷酸酶试剂盒南京建成生物工程研究所。
1.2仪器与设备
AA-6300C原子吸收分光光度仪日本岛津公司；XR-36双能X线骨密度仪美国Norland公司；5810/R低温高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；Ⅰ型游标卡尺南京三丰机电有限公司。
1.3方法
1.3.1自制缺钙饲料和普通饲料
实验为建立缺钙模型，自制缺钙饲料，配方见表1。经原子吸收法测定，其中钙含量为0.01%。为了保证基础营养成分的一致，同时自制了钙含量0.35%的普通饲料，其中钙来源于添加的CaCO3。
1.3.2EWP-Ca的制备
双酶法制备蛋清肽参照文献[7]方法，将上清液过截留分子质量为5kD的超滤膜，滤液冷冻干燥得蛋清肽粉，配制成4g/100mL的初始肽液，在55℃、pH9.5、肽粉与CaCl2质量比2.5:1的条件下，与0.5g/mLCaCl2溶液混合搅拌20min，经过乙醇沉淀、离心分离及冷冻干燥后，制得EWP-Ca。
1.3.3指标测定
钙含量测定参照文献[8]所述方法进行；粗蛋白含量测定：采用微量凯式定氮法[9]；多糖含量测定：参照GB/T9695.31—2008《肉制品总糖含量测定》方法。
1.3.4分组与给药方式
大鼠经适应性喂养5d后，随机分为6组，每组10只，分别为普通组、缺钙模型组、CaCO3组和EWP-Ca低、中、高剂量组。各组动物喂以对应的饲料，普通组和缺钙模型组灌胃去离子水。EWP-Ca低、中、高剂量组，分别为每天灌胃不同剂量的EWP-Ca；CaCO3组每天灌胃CaCO3，折算钙元素含量与EWP-Ca高剂量组相同。灌胃量为0.3mL。每两天称量一次动物体质量。具体方法见表2。实验至30d后，将动物摘眼球处死，收集血液，4℃、104r/min离心15min，取出血清。同时取出两侧股骨，分别放入烘箱中60℃条件下烘干至恒质量。
1.3.5血清钙、磷及碱性磷酸酶测定
参照南京建成生物工程研究所试剂盒方法测定。
1.3.6股骨干质量、长度、直径、骨密度及骨钙含量的测定
取出大鼠左侧股骨，用游标卡尺精确测定长度、股骨中心直径。采用NorlandXR-36双能X线骨密度仪测定左股骨骨密度。取右侧烘干后的股骨称量股骨干质量，再经混和酸(硝酸、高氯酸体积比4:1)湿法消化后，以0.5%的氯化锶溶液定容，采用原子吸收分光光度计测定骨钙含量。
1.4数据统计与处理
运用SPSS统计软件包进行单因素方差分析和LSD检验。
2结果与分析
2.1大鼠饲料组分分析
大鼠对各种营养物含量的需求为蛋白质＞20%，碳水化合物＞60%，钙元素约0.5%。由表3可知，普通饲料组分测定结果基本可满足大鼠正常生长的需要，不会产生营养缺乏病；缺钙饲料则要求钙含量＜0.1%，故也符合要求。
2.2蛋清肽-钙配合物对大鼠血清指标的影响
由表4可知，缺钙模型组大鼠血清钙含量极显著低于其余5组(P＜0.01)，说明通过饲喂自制的缺钙饲料来构造缺钙模型是成功的；各组之间血清磷含量差异均不显著(P＞0.05)；除低剂量EWP-Ca外，其余4组的血清碱性磷酸酶(AKP)的活力均极显著低于缺钙模型组(P＜0.01)，且高剂量EWP-Ca组明显低于相同钙剂量的CaCO3组，两者之间差异达极显著水平(P＜0.01)。血清AKP是由成骨细胞释放，在肝脏功能正常的情况下，血清AKP水平能较好地反映成骨细胞的活动状况，是骨形成的特异性指标。血清中的AKP主要来自肝脏与骨胳，当处于一些疾病状态下AKP会释放进入血清。缺钙模型组的血清AKP最高，说明该组动物由于缺钙严重，出现了高骨转换状态，因此AKP值不断上升，这与刘忠厚[10]研究骨质疏松导致的高骨转换率时，AKP明显升高的结论相一致。