土壤功能微生物SIP鉴定

传统的功能微生物鉴定方法是在含有特定碳源培养基上对目标微生物进行富集、分离与纯化，由于实验室可培养的微生物只占微生物总数的0.1~1%[1]，因此以纯培养技术为代表的鉴定方法存在很大局限性。20世纪后半叶，以分子生物学为特色的现代土壤微生物研究方法取得突破性进展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技术为代表的生物化学方法，以BIOLOG技术为代表的生理学方法和基于DNA多态性的微生物群落结构和功能多样性的分子生态学技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）、末端限制性酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）和实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）等。上述技术提高了人们对土壤微生物群落结构组成的认识，但仍难提供有关微生物间相互作用及代谢功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指纹图谱方法只能检测环境样品中的优势微生物群落，但具有特定生态和环境功能的微生物通常在数量上并不占优势[3]。因此，功能微生物很难被这些分子指纹图谱方法所鉴别[2]。据估算，每克土壤含有约100亿个微生物个体，包括100万种不同的微生物种群。利用上述技术，从这些难以计数的土壤微生物中原位鉴别特定生态过程的微生物驱动者是难以想象的[4]。近年来得到广泛关注的稳定性同位素探针技术与现代分子生物学相结合，可以在相对未受干扰的环境样品中培养功能微生物，利用稳定性同位素示踪复杂环境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鉴定生态系统重要过程的微生物驱动者。其基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，土壤中利用该标记底物的微生物细胞在其生长繁殖过程中同化合成含标记元素的生物标志物。通过对生物标志物进行提取、分离、鉴定和比对分析，鉴别土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法可以准确获得功能微生物的目的基因，避免了从浩瀚基因库里一个个筛选目的基因的烦劳工作，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段。

1土壤功能微生物SIP鉴定技术流程

SIP技术是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一，该技术以复杂的原位或微宇宙土壤样品为研究对象，采用稳定性同位素原位标记土壤样品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前绝大多数研究采用13C标记底物培养土壤，利用13C-底物的微生物细胞不断分裂、生长、繁殖，合成含13C标记的DNA或RNA等生物标志物。提取土壤样品中13C-核酸和12C-核酸总混合物，用超高速离心技术将13C-核酸与12C-核酸分离，利用分子生物学手段对生物标志物进行分析，以鉴别土壤功能微生物。近年来，以15N和18O为基础的SIP技术也被成功应用于微生物驱动的土壤生态过程研究[6]。

1.1土壤SIP技术前处理方法选择

SIP技术前处理包括标记底物的培养和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取两个步骤。培养方式主要包括添加营养液富集培养和仅添加标记底物培养等方式。添加营养液富集培养法可以为微生物生长提供相对稳定的环境，并促进微生物的生长，以获得足够的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括试剂盒提取法和液氮研磨法等。试剂盒法操作简单，提取纯度高，但提取量较低，费用高。液氮研磨法可以较好保证DNA/RNA的完整性，提取量相对较高，且操作费用低，时间短，但需纯化后才能满足RT-PCR等后续分子生物学要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要为两种：一种是PLFAs法，即先通过氯仿-甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态FAME，提取的脂肪酸种类仅有El-脂肪酸，多为细菌所特有。另一种是TSFAMEs法，即通过碱甲醇分解法提取总土壤FAMEs。提取的脂肪酸种类包括酯连接和非酯连接PLFAs，多为真菌所特有[9]。

1.2土壤SIP技术中生物标志物的选择

土壤SIP技术中特定微生物的生物标志物为PLFA、DNA和RNA3种。PLFA-SIP法是将PLFA从重稳定性同位素（如13C）标记过的环境样品中提取出来，通过PLFA图谱分析微生物群落的结构和多样性，再通过气相色谱-燃烧-同位素比率质谱联用法测定各种PLFA中13C的丰度[7]。PLFA-SIP的标记底物浓度要求较低，灵敏度较高，但存在一些缺点：（1）对于未知PLFA分子图式的不可培养微生物，或者土壤中的某种特殊脂肪酸无法与特定种类的微生物相对应，该方法就无法鉴定功能微生物。（2）该方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定土壤微生物群落结构，标记上的变动将导致群落估算上的偏差。（3）细菌和真菌生长条件的改变或环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可获得更直接的功能微生物遗传信息。DNA-SIP的优点是：标记的13C-DNA一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物原位生长并驱动生态过程的最直接证据。另外，DNA完美的双链结构保证了遗传物质的稳定[10]。DNA-SIP的缺点是：自然环境中能被微生物利用的底物浓度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用较高浓度的标记底物来刺激目标微生物的分裂繁殖，可能导致研究结果与原位自然环境的实际情况不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺点。自然环境中特定功能微生物发挥作用的同时，即使没有大量增殖生长，但具功能基因得到表达并在核糖体内合成蛋白质，获得标记的13C-RNA则表明微生物可能具有较强的活性。因此，RNA-SIP能够采用更低的标记底物浓度培养环境样品，研究结果更接近原位状况[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的实际应用仍存在较大的技术难度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的结合将会大大提升SIP技术的潜力。

1.3土壤SIP分离后的分析方法

13C-核酸与12C-核酸分离后，可以利用分子生物学手段对功能微生物的DNA/RNA进行分析，以鉴别土壤中重要生态过程的微生物驱动者。目前的主要分析方法包括分子指纹图谱法、实时定量PCR法和454高通量测序法等。（1）分子指纹图谱法是目前进行功能微生物的DNA/RNA分析的广泛使用的快捷方法，但分子指纹图谱分析方法的灵敏度较低。环境样品中微生物通常数以百万计，采用古菌或细菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能检测环境样品中数量上占优势的微生物[14]。具有较为重要的生态和环境功能目标微生物通常在数量上不占优势。因此，目标微生物同化利用13C-底物后发生的微小变化很难被分子指纹图谱法所鉴别。（2）实时定量PCR法直接针对目标微生物的功能基因，采用高度灵敏的实时定量PCR测定不同密度层级中目标微生物的数量，显著提高了SIP技术的可靠性。然而，采用特异引物定量研究目标微生物存在一定难度。土壤中数量众多的微生物基因组DNA可能被13C标记，很难采用单一的功能基因或16SrRNA基因特异引物，同时研究众多目标微生物在不同密度层级中的分布规律。我们无从得知哪一种微生物可能利用稳定性同位素标记底物，无法设计特异的功能引物，只能通过选择性定量目标微生物，明确目标微生物在不同密度层级中的分布规律，同时判定SIP技术的可靠性[13，15]。（3）454高通量测序法是通过检测各浮力密度层中微生物16SrRNA基因组成，分析目标标记微生物占该层总微生物的比例，从而鉴别前所未知的重要功能微生物。该技术可规避PCR扩增，直接对标记13C-RNA测序，每次分析可获得大约100万16SrRNA基因序列，显著增强了重浮力密度层中13C-标记微生物DNA序列的检测灵敏度。高通量测序可全面分析微生物群体的物种、基因功能组成，最大程度地认识未培养微生物的遗传组成和生命活动，是目前最准确的方法[16]。但该方法目前测试费用较高，后续数据处理复杂，但随着技术发展必将成为功能基因组学研究的主流技术。