红树林放线菌的多样性

结核病（TB）为结核分枝杆菌（Mycobacteri－umtuberculosis）引起的慢性传染病，据WHO估计，目前全世界约有1/3的人受到结核菌感染，每年新发病例800万，死亡人数达200万（Kochi，1991）。我国结核病疫情非常严重，为全球结核病高负担国家之一，现有结核病患者451万，其中菌阳肺结核病人200万，耐药结核病占27.8%，多重耐药结核（MDR-TB）为10.7%（端木宏谨，2002；刘红宇等，2002）。目前标准的结核病疗法周期长且较为复杂，对于免疫抑制的患者效果不好，所以迫切需要发现新的抗结核药物先导化合物，开发能有效治疗MDR-TB和潜伏性结核杆菌感染、缩短治疗周期的药物（Nayyaratal，2005；Lluis，2005）。

海洋微生物是重要药物资源（Wagneretal，2002；Kelecom，2002；Prokschetal，2002）。红树林是热带、亚热带潮间带陆海交汇的海湾河口地区特有的生态系统，其特点是咸淡水交迭，规律性地受到海水浸泡和露空，这一特殊的生态环境造就了丰富而特有的微生物资源（林鹏，1997），被认为是分离放线菌的理想环境（Jensenetal，1995；闫莉萍等，2005；张乔民等，1997），陈华（2006），刘颖（2007）对从海南、广西与广东三省的红树林区广泛采集红树林生态环境中的各种生物样品如土壤、植物的根、叶和果，红树林底栖动物等，采用分离纯化后的微生物或不经分离的混合微生物发酵培养，进行抗金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），白色念珠菌（Candidaal－bicans）、黑色素瘤B16及子宫颈癌Hela等细胞毒活性等筛选，证明红树林微生物是很好的药物资源，同时还得出土壤样品来源的活性放线菌比例要高于根、叶、果及底栖生物样品来源的活性菌株比例。肖静等（2008）从福建漳州红树林保护区采集土壤样品中分离到163株放线菌，用5种指示菌和3种肿瘤细胞测定它们的抗菌活性和抗肿瘤活性，结果表明，其中42.3%的放线菌发酵液具有单一或多种抗菌活性，37.4%的放线菌发酵液具有单一或多种抗肿瘤细胞毒活性。以上这些实验结果，都显示了红树林土壤放线菌有巨大的药用潜力。但是，关于红树林土壤放线菌抗分枝杆菌潜力从未被过报道。

本研究采集了广东珠海、深圳红树林保护区及惠州白沙村、阳江的莲北村、红光村、北津村等四个原生态的红树林保护区不同红树植物根部土壤，对其可培养的放线菌的多样性进行了初步分离研究，并以天然耐药的耻垢分枝杆菌（Mycobacteri－umsmegmatis）做指示菌，对分离得到的放线菌进行抗分枝杆菌活性筛选，旨在寻找新型的抗耐药性结核菌先导化合物。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土壤样品

土壤样品分别采自珠海市淇澳岛红树林保护区，深圳市福田区红树林鸟类自然保护区，惠州市惠东县盐洲镇白沙村，阳江市阳东县东平镇莲北村，阳江市阳西县程村镇红光村，阳江市阳东县雅韶镇北津村原生态红树林保护区，采样位置选择不同红树植物根部附近。

1.1.2放线菌分离培养基（朱九滨等，2005）

改良高氏（Gause′）sⅠ号，其中添加重铬酸钾作为真菌抑制剂，培养基中还添加了50%陈海水。

1.1.3指示菌及抗分枝杆菌活性筛选培养基（莎姆布鲁克，2005）

指示菌：耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmeg－matis），购自中国科学院微生物研究所，筛选时采用的培养基是，LB培养基，LB液体培养基。

1.1.4筛选样品发酵培养基

用作活性筛选的放线菌采用高氏（Gause′s）Ⅰ号培养基发酵培养，培养基中添加50%陈海水。

1.2方法

1.2.1土壤样品采集方法（陈华等，2006）

在离目标树种0.5~1m的范围内，用经过高压灭菌的钢铲采集离地面5~20cm处的土壤，土壤样品采集后保存于无菌培养皿中，置于冰上保存，编号，注明采样时间、地点、植物种类等，于当天运回实验室分离。

1.2.2放线菌分离纯化方法（Hayakawa，2004）

土壤样品预处理方法：称取1g新鲜土壤样品到10ml的无菌水中，加入6%酵母浸膏和0.05%SDS（5mmol/L磷酸缓冲液），于40℃振荡20min，转速为200rpm，备用。用移液枪吸取100μl处理好的样品悬浮液到琼脂平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面涂布均匀，并于28℃恒温培养1~4周，挑取不同放线菌菌落于新的培养基中培养，并对菌株进行划线纯化。

1.2.3筛选样品制备（Smedsgaard，1997a，1997b）

将分离到的红树林放线菌用接种针挑取少许菌体接种到筛选培养基上，室温下培养约7d以上，将培养基连同菌体全部刮下置于100mL烧杯中，加入100ml甲醇：二氯甲烷：乙酸乙酯混合溶剂（3∶2∶1，v/v/v）超声提取2次，每次超声90s，提取液过滤，合并滤液，减压蒸干溶剂，在浸膏中加入甲醇，配成含量为10mg/mL的待筛选样品。

1.2.4抗分枝杆菌活性筛选方法（Laietal，2009）

抗分枝杆菌活性筛选采用K-B法：吸取0.5ml耻垢分枝杆菌悬液至小试管，用相对应的液体培养基稀释到5ml，取100μl稀释菌液到相应培养基平板上涂布均匀，作为测定平板。取10μl待筛选样品，滴加在直径6mm的滤纸片上，把含有受试样品的滤纸片放入已制好的测定平板上，于37℃恒温倒置培养1~2d，观察出现的抑菌圈情况。空白对照采用甲醇。

2结果与分析

2.1放线菌分离结果与分析

本研究样品的采集地是珠海市淇澳岛、深圳市福田区红树林保护区以及惠州市惠东白沙村、阳江市的莲北村、红光村、北津村这四个原生态红树林保护区，涉及到的红树树种有老鼠?（Acanthusilicifolius），白骨壤（Avicenniamarina），无瓣海桑（Sonneratiaapetala），木榄（Bruguieragymnor－rhiza），卤蕨（Acrostichumaureum），海桑（Son－neratiaeCaseloaris），秋茄（Kandeliacande）l，桐花树（Aegicerascorniculatum），车桑子（Dodonaeaviscosa（Linn）.），银叶树（HeritieralittoralisDryand）.，海芒果（Cerberamanghas），角果木（Ceriopstaga）l，红海榄（Rhizophorastylosa）等专属性红树植物及苦楝（Meliaazedarach），海漆（Excoecariaagallocha），鱼藤（DerrisLou）r等伴生红树植物，共采集泥样45份，获得放线菌177株，分离结果见表1。