石斑鱼肉肽粉的氨基酸组成分析与营养价值评价

　　摘要 以珍珠龙胆石斑鱼鱼肉为材料，采用生物酶解法制备蛋白酶解产物并进行超滤处理，分析了酶解产物和各超滤组分的粗蛋白含量和氨基酸组成，评价其营养价值。结果表明，珍珠龙胆石斑鱼的酶解产物和各超滤组分的粗蛋白含量为 63.41%~67.53%，胶原蛋白含量为 3.65%~5.97%，必需氨基酸含量占总氨基酸含量的比例为 67.09%~71.52%;酶解产物和各超滤组分的必需氨基酸组成齐全、含量丰富、比例相对均衡，具有较高的营养价值。经过超滤分离的石斑鱼肉肽粉可作为具有多种生物活性功能产品的优质原料。

　　徐杰; 廖津; 林泽安; 唐振冬; 范秀萍; 孙钦秀; 刘书成; 苏伟明， 食品与发酵工业 发表时间：2021-08-25 10:03 期刊

　　关键词 酶解产物;蛋白质;氨基酸;营养价值;珍珠龙胆石斑鱼

　　珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus×E. lanceolatus)，属于鲈形目、鮨科、石斑鱼属，具有成长快、病害少、抗逆性强、肉质细腻、营养丰富等优点，是我国南方海水养殖的重要经济鱼类之一，年产量高达 10 万 t，产值超 100 亿元[1-3]。珍珠龙胆石斑鱼的销售主要以活鱼为主，但由于保活流通技术的限制，其死亡率较高，死亡石斑鱼的销售价格大大降低。针对死亡的珍珠龙胆石斑鱼，采用一些技术手段开发高附加值产品(如酶解制备活性肽、提取鱼油等)，可以提高其经济价值。

　　目前，利用水产蛋白通过酶解制备生物活性肽是研究和消费市场关注的热点之一。因为这类生物活性肽具有抗氧化、降血压、抗凝血、提高免疫力等多种生理功能，且容易被机体吸收[4-7]。珍珠龙胆石斑鱼肉是一种优质蛋白质来源(85.19%，干背基)，必需氨基酸(essential amino acid，EAA)含量高(34.56%，干背基)[8]，是开发生物活性肽的优质原料，但相关研究还鲜有报道。

　　本研究以保活流通过程中死亡的珍珠龙胆石斑鱼为对象，采用生物酶解制备小分子肽，并对其超滤处理，分析超滤组分的蛋白质含量和氨基酸组成，评价其营养价值，为利用珍珠龙胆石斑鱼肉酶解产物开发生物活性肽提供基础数据，实现其高值化利用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　珍珠龙胆石斑鱼来自实验室保活流通试验中刚死亡的，鱼体完整、健康，个体质量为(500±50) g。取鱼肌肉，经高速组织捣碎机捣碎后，等量分装，-20 ℃冰箱保存备用。

　　风味蛋白酶(酶活力 30 000 U/g)，广西南宁东恒华道生物科技有限责任公司;柠檬酸钠，上海碧云天生物技术有限公司;分子标准品：杆菌酶(M：1 450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M：451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M：189 Da)，乙腈(色谱纯)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;羟脯氨酸测试盒，南京建成生物工程研究所;盐酸(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 仪器与设备

　　HHS 型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;BSA224S-CW 型万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;Varioskan Flash 型酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司; pHS-3C 型雷磁 pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司;VAP450 型全自动凯氏定氮仪，德国格哈特分析仪器有限公司;L-8900 型全自动氨基酸分析仪，日本日立公司;LC20AD 型高效液相色谱仪，日本岛津公司。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 石斑鱼肉酶解产物超滤组分的制备

　　采用课题组前期优化的酶法工艺[9]制备珍珠龙胆石斑鱼肉酶解产物(enzymatic hydrolysates， EH)，具体工艺参数如下：鱼肉与水的比例 1:3.5、pH 7、温度 53 ℃、风味蛋白酶添加量 1 050 U/g，酶解 5.5 h 后煮沸灭酶，再冷却至室温，离心取上清液。分别采用 8、5、3 kDa 的超滤膜对酶解液进行分离，获得 4 种组分：EH-1(>8 kDa)、EH-2(5~8 kDa)、EH-3(3~5 kDa)和 EH-4(<3 kDa);对 4 种组分分别进行蒸发浓缩和真空冷冻干燥，获得 4 种鱼肉肽粉产品。

　　1.3.2 蛋白质含量测定

　　参考 GB 5009.5—2016，采用凯式定氮法测定鱼肉肽粉的蛋白质含量。

　　1.3.3 胶原蛋白含量测定

　　羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中，而在其他蛋白中含量较少，甚至不存在。本实验采用试剂盒法测定鱼肉肽粉中的羟脯氨酸含量，然后乘以换算系数转换为胶原蛋白含量。水生动物的换算系数一般为 11.1[10]，胶原蛋白含量计算如公式(1)所示：胶原蛋白含量(μg/mg) = 羟脯氨酸含量(μg/mg) × 11.1 (1)

　　1.3.4 氨基酸组成测定

　　参考 GB 5009.124—2016，采用酸水解进行前处理后测定鱼肉肽粉的氨基酸组成。

　　1.3.5 相对分子质量分布测定

　　参考 GB/T 22729—2008，采用高效凝胶过滤色谱法测定鱼肉肽粉的相对分子质量分布。

　　1.3.6 营养价值评价

　　采用氨基酸评分(amino acid score，AAS)、化学评分(chemical score，CS)、氨基酸比值(ratio of amino acid，RAA)、氨基酸比值系数(ratio coefficient，RC)、氨基酸比值系数分(score of ratio coefficient，SRC)，对鱼肉肽粉进行营养价值评价[11-12]。

　　1.3.7 数据处理与分析

　　每个试验重复 3 次，数据用平均值±标准差表示;用 SPSS 软件进行单因素方差分析和 Duncan 多重比较进行组间显著性分析，P<0.05 表示显著性差异。

　　2 结果与分析

　　2.1 鱼肉肽粉的粗蛋白和胶原蛋白含量

　　从表 1 可知，石斑鱼肉肽粉中粗蛋白含量较高，达到 63%以上，是优质的蛋白质来源。包斐[13] 采用酶解法制备长蛇鲻鱼肉蛋白粉，其蛋白含量高达 74.68%，略高于本实验结果，这可能与酶解制备工艺有关，还可能与鱼的品种有关。石斑鱼肉肽粉的胶原蛋白含量较低，在 5%左右。张延华等[14] 测定了鲈鱼、鮻鱼、草鱼和鲤鱼等鱼肉中的胶原蛋白，其含量与本实验结果接近。虽然石斑鱼肉肽粉中胶原蛋白含量偏低，但其具有较强的抗氧化等生物活性，可以增强其肽粉的功能特性。

　　2.2 鱼肉肽粉的氨基酸组成

　　从表 2 可知，EH-2 未检出天冬氨酸和丝氨酸，EH、EH-1、EH-3、EH-4 均含有 16 种氨基酸;5 种鱼肉肽粉均含有 7 种人体 EAA(色氨酸未测)，总氨基酸含量(total amino acids，TAA)在 16.47~18.81 g/100g，EAA 含量在 11.11~13.44 g/100g，其 EAA 占 TAA 的比例在 67.09%~71.52%。F 值是指支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)与芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)含量的比值，F 值越大说明蛋白质潜在的生物活性可能越好[15]。从表 2 可知，鱼肉肽粉经过超滤分离后，各分离组分的 F 值比未分离 EH 的高，说明超滤分离可以提高肽粉的潜在生物活性功能。

　　从表 2 还可知，石斑鱼肉肽粉的亮氨酸含量最高(2.95~3.85 g/100g)，较高的亮氨酸水平饮食对激活胰岛素信号通路有着重要作用，从而增强机体的糖酵解和脂肪酸的合成[16]，此外，与亮氨酸同属于支链氨基酸的缬氨酸和异亮氨酸的含量也比较丰富，有增强免疫力、防止肌肉损伤的功能。石斑鱼肉肽粉的赖氨酸含量也较高，占氨基酸总量的 8.6%以上。赖氨酸是谷物类食品的第一限制氨基酸，故石斑鱼肉肽粉可作为以谷物为主的膳食模式的赖氨酸补充剂，同时赖氨酸还具有促钙吸收、促食欲、促进幼儿生长发育、减轻焦虑等功能[17]。石斑鱼肉肽粉的苯丙氨酸含量也较高，达到了 1.96 g/100g 以上。苯丙氨酸可以调节人体中酪氨酸的浓度[18]，合成神经递质和激素，参与机体代谢。石斑鱼鱼肉肽粉的精氨酸同样含量丰富，均在 1.7 g/100g 以上，占 TAA 含量的 10%左右。精氨酸是婴儿的 EAA，也是人体多种物质的合成底物，如肌酸、NO、多胺、脯氨酸、谷氨酸和高精氨酸等，与血管舒张、免疫、神经传递、能量代谢和预防多个系统的功能障碍有关[19]。因此，石斑鱼肉肽粉是 1 种较好的人体 EAA 来源，可作为开发适合各年龄阶段的功能食品原料。

　　2.3 鱼肉肽粉的呈味特征

　　蛋白酶解产物的呈味特征很大程度取决于氨基酸的种类与含量[20]。味道强度值(taste activity value，TAV)是评价呈味物质对呈味特征贡献程度的重要指标，它是指呈味物质的浓度与其呈味阈值的比值。当 TAV < 1 时，说明该呈味物质对呈味特征的贡献较小;TAV 越大说明该呈味物质对呈味特征的贡献越大。石斑鱼肉肽粉的呈味特征见表 3。从表 3 可知，石斑鱼肉肽粉的呈味特征为苦味>>鲜味>甜味。且除脯氨酸和酪氨酸 TAV < 1 外，鱼肉肽粉中其他氨基酸 TAV 均>1。

　　谷氨酸和天冬氨酸能为食品提供鲜味，决定食品的鲜美程度，且普遍认为谷氨酸对鲜味的作用大于天冬氨酸，同时各组分谷氨酸的 TAV 值均大于天冬氨酸的 TAV 值，因此，谷氨酸是石斑鱼肉肽粉的主要鲜味来源。各组分的甜味氨基酸 TAV 值均为丙氨酸最高，明显高于其他甜味氨基酸，是甜味的主要来源。研究表明[15]，丙氨酸是水产品中重要的甜味氨基酸，可与谷氨酸等鲜味氨基酸协同呈鲜。

　　蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等为鱼肉肽粉贡献较多的苦味，故该肽粉整体呈现苦味。有研究表明[23]，水产蛋白的酶解产物通常具有一定的苦味，这是由于在酶解过程大分子蛋白质水解成小肽，较多的疏水性氨基酸和碱性氨基酸暴露。根据相关研究[24]，含有苦味的物质分子质量在 1 kDa 以下的占 85.1%，而鱼肉肽粉正是小分子肽产品。通过促进多肽的卷曲，使疏水性氨基酸隐藏在肽链内部，以及深度酶解促使疏水性氨基酸残基转化为游离氨基酸，都能使肽粉的苦味减少[25]。

　　2.4 鱼肉肽粉的营养价值评价

　　当前营养学界认为：蛋白质的营养价值与其氨基酸组成有关，当食物蛋白质的氨基酸模式越接近于人体蛋白质构成时，被机体利用的程度越高，营养价值也越高。目前，AAS 和 CS 是评价氨基酸营养价值最主要的方法，但是具有片面性，而世界卫生组织(World Health Organization，WHO)/联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)提出以氨基酸模式来评价蛋白质营养价值，同时根据氨基酸模式来计算 RAA、RC 以及 SRC，可以较为直观反映样品氨基酸含量偏离氨基酸模式的程度及 EAA 对氨基酸平衡的影响[26]，综合运用这些方法可以较为全面、准确地评价样品的相对营养价值。

　　AAS 是指样品中某种 EAA 的含量与 FAO/WTO 推荐的理想蛋白同种氨基酸含量的比值，其中最小的 AAS 值就是该样品的氨基酸分，AAS 最小的 EAA 被称为该样品的第一限制氨基酸。如果样品中某种 EAA 的 AAS<1，说明该样品的 EAA 模式不满足 FAO/WTO 推荐的理想蛋白模式，其蛋白质的营养价值偏低;如果样品所有 EAA 的 AAS 都>1，说明该样品的蛋白质营养价值较高。石斑鱼肉肽粉的 AAS 为 1.56，经超滤处理后除了 EH-2 组分外，其他分离组分的 AAS 均>1，这也说明石斑鱼肉肽粉及其超滤分离组分均有较高的营养价值。李慧凝等[27]以酶解法制备鲣鱼肽，鲣鱼肽的 AAS 均近似或大于 1.0。因此，从蛋白质角度来讲，鱼肉肽具有较高的营养价值。

　　CS 是指样品中某种 EAA 含量与鸡蛋蛋白中同种氨基酸含量的比值，其比值的意义与 AAS 一样。石斑鱼肉肽粉的 CS 分别为 1.19、1.19、0.32、1.52、1.45，说明除 EH-2 外其他组分的蛋白质营养价值在一定程度上优于鸡蛋蛋白质。

　　蛋白质的营养价值与其 EAA 的种类、数量及平衡状态密切相关。从表 6 可知，石斑鱼肉肽粉的 EAA 占 TAA 的比值除 EH-2 组分的苏氨酸外，均优于模式值。石斑鱼肉肽粉 EAA 中亮氨酸占比特别高，为模式值的 2.5 倍以上;苯丙氨酸+酪氨酸以及赖氨酸占比也较高，为模式值的 2 倍以上。单个氨基酸占比过高或过低于模式值均会影响氨基酸平衡，但是各组分的 EAA 占比的变化规律与模式值相似。总体而言，该肽粉的 EAA 种类齐全，含量丰富，且组成合理，是 1 种优质氨基酸产品。

　　通过计算 EAA 的 RAA、RC、SRC 来评价样品的营养价值。从表 7 可知，EH-3 的 SRC 值最高达到了 80.43，EH-2 的 SRC 值较低为 53.44，各样品的氨基酸平衡性为：EH-3 > EH-1 >EH > EH-4 >EH2，且蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸+酪氨酸的 RC 值接近 1，表明 5 种 EAA 含量比例与氨基酸模式最接近。各组分的亮氨酸的 RC 值最高，但苏氨酸和缬氨酸的 RC 值均<1，EH、EH-1、EH-2 的第一限制氨基酸为苏氨酸，同时 EH-2 的苏氨酸 RC 值只有 0.19，对氨基酸平衡起着很大的负作用;而 EH-3、EH-4 的第一限制氨基酸为缬氨酸。综上所述，石斑鱼肉肽粉是 1 种营养价值较高的海洋来源蛋白。

　　2.5 鱼肉肽粉的相对分子质量分布

　　根据实验前期结果[9]及 SRC，选取石斑鱼肉肽粉中抗氧化活性较高同时比值系数分最高的组分 EH-3，分析其相对分子质量分布。从图 1 可知，EH-3 分子质量为 249 Da，且 EH-3 组分中分子质量在 1 kDa 以下的含量为 97%，说明经过酶解之后的鱼肉大部分降解为小分子肽，容易被人体吸收[29]。巫楚君等[30]通过复合蛋白酶酶解黄鳍金枪鱼肉，其酶解产物分子质量大部分在 1 kDa 以下，本试验结果与之相似。

　　3 结论

　　珍珠龙胆石斑鱼肉肽粉是 1 种高蛋白食物，粗蛋白质含量达 63.41%以上;鱼肉肽粉的 EAA 组成齐全、含量丰富、比例相对均衡，具有较高的营养价值。经过超滤分离的石斑鱼肉肽粉为开发具有多种生物活性功能产品提供了优质的原料，然而肽粉还呈现出一定的苦味，如何消减或消除肽粉的苦味还有待于进一步深入研究。