基于网络药理学及实验验证探讨“山慈菇-漏芦”药对治疗乳腺癌作用机制

　　[摘要] 目的：应用网络药理学的研究方法筛选“山慈菇-漏芦”药对治疗乳腺癌的作用靶点及相关信号通路，通过体外实验明确其作用机制。方法：通过运用中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库检索获取“山慈菇-漏芦”的主要化学成分以及相关作用靶点;使用 GendCards 筛选乳腺癌疾病的相关靶标基因;通过 Venn 软件筛选出药物与疾病的共同作用靶点;构建出药物-疾病的靶点网络;蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)的构建;通过基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析对有效作用靶点进行分析;通过细胞增殖与活性检测(CCK-8)实验、流式细胞术检测细胞凋亡实验、蛋白质免疫印迹法(Western blot)实验进行进一步的实验验证。结果：通过筛选得到“山慈菇-漏芦”有效化学成份 7 个，有效作用靶点 61 个，其中作用于乳腺癌的相关靶点 55 个。通过 GO 富集分析共富集到条目 832 个，在生物学过程方面集中体现。 KEGG 通路富集分析共富集到 85 个条目，包括肿瘤抑制基因信号通路 p53，血管内皮生长因子(VEGF)信号通路，人表皮生长因子受体(EGFR)信号通路、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信号通路等信号通路。通过体外实验验证了“山慈菇-漏芦”醇提取物可抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖，并诱导了细胞的凋亡，与空白组，二甲基亚砜(DMSO)组(0.1% 溶剂组)相比较，给药组 MDA-MB-231 细胞吸光度显著降低(P<0.01)，凋亡率显著增高(P<0.01)，Western blot 实验结果表示，与空白组和 DMSO 组相比较，各给药组细胞中磷酸化(p)-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 比值均明显降低(P<0.05)。结论： “山慈菇-漏芦”醇提取物能有效抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖，并可以诱导其凋亡，作用机制可能与抑制 PI3K/Akt 信号通路活化相关。

　　[关键词] 网络药理学;乳腺癌;山慈菇;漏芦;作用机制

　　王冰; 王玥; 朱仲康; 崔勇; 于嵩; 刘海兴; 王旭， 中国实验方剂学杂志 发表时间：2021-11-03

　　乳腺癌是女性发病率较高的恶性肿瘤之一，有相关报告指出，2018 年全球女性乳腺癌的发病率为每 10 万人 46.3 人，死亡为 13.0 人，近年来呈显著上升的趋势[1]。有相关研究指出[2]，不同分子分型的乳腺癌中，与非三阴型乳腺癌相比较，其中三阴型乳腺癌的复发及内脏的转移率均较高，并且生存率较低，预后较差，是影响患者预后的独立危险因素。而对于此类型乳腺癌的治疗，采用化疗易发生耐药，并且缺少内分泌治疗靶点[3]。近年来，有研究表示[4]，中医药治疗乳腺癌也取得了明显的效果，并且越来越多的患者都在逐步积极接受中医药的治疗。有实验研究发现，山慈菇和漏芦两药均有通过影响细胞增殖、凋亡以及细胞侵袭等多个方面来达到抗乳腺癌的作用[5-7]。李秀荣教授在治疗乳腺癌药对经验总结中提到，山慈菇、漏芦两药配伍具有明显清热解毒、散结抗癌的功效，并提出两药配伍在临床上有显著抗乳腺癌的功效[8]。在临床应用中，散结类药物在抗乳腺癌方面效果显著，比如临床常用制剂乳核散结片，该制剂中的主要成分山慈菇、漏芦被广泛应用在抗乳腺癌治疗的方剂配伍当中，并有显著的效果。但目前对两药联合作用并且从细胞和分子水平来系统地阐述其抗乳腺癌的作用机制的研究较少，因此本研究通过网络药理学的研究方法筛选出“山慈菇-漏芦” 药对的有效成分，进一步构建“药物-疾病”靶点的网络图，并探讨该药对抗乳腺癌的相关作用机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 药物关键化合物的筛选

　　运用中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索出山慈菇、漏芦的主要有效化学成分，再对两药的化学成分进行口服利用度(OB)以及药物相似性(DL)筛选，设置筛选条件为 OB≥30%，DL≥18%。

　　1.2 山慈菇、漏芦化合物关键靶点及乳腺癌靶点的筛选

　　利用 TCMSP 检索山慈菇、漏芦化合物的关键作用靶标基因，利用 UniProt 数据库(https://www.uniprot.org/)检索出靶标基因对应人类基因的名称。乳腺癌相关疾病的靶标基因通过 GeenCards 数据库检索获得。

　　1.3 构建“药物-疾病”靶点网络及可视化分析

　　利用 Venn 在线软件选取药物与疾病共同靶点，并绘制 Venn 图，利用 Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化分析。

　　1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

　　将筛选得到的药物-疾病共同靶点基因导入 STRING 数据库，得到 PPI 网络，进一步筛选出靶点基因。

　　1.5 基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

　　将“山慈菇-漏芦”的靶蛋白上传到 DAVID 6.8 数据库，通过分析了解“山慈菇-漏芦”药对的有效成分对于乳腺癌的 GO 功能，进行 KEGG 通路分析找到相关靶标在通路中的分布情况，直接观察到“山慈菇-漏芦”药对作用于乳腺癌的主要机制途径。

　　2 实验验证

　　2.1 材料

　　人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞株购于中国科学院上海细胞库。

　　山慈菇、漏芦中药饮片[天马(安徽)国药科技股份有限公司];胎牛血清(FBS)(Clark 公司，批号 FB15015，);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen 公司，批号 25200056);DMEM 培养液(Hyclone 公司，批号 SH30022.01B);细胞增殖与活性检测(CCK)-8 试剂盒(Solution Vazyme 公司，批号 A311-01);二甲基亚砜(DMSO，美国 Sigma 公司，批号 D2650);Annex in V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(美国 Everbright Inc 公司，批号 40302ES20，);BCA 法蛋白定量试剂盒(碧云天生物科技公司，批号 P0012);兔抗人磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)，磷酸化(p)-PI3K，蛋白激酶 B(Akt)，p-AKT(美国 Cell Signaling Technology 公司，批号分别为 ABP50495，ABP59902，4691S，4060S)。

　　AVC-4D1 型超净工作台(新加坡艺思高科技有限公司);HERAcell 150i 型高温灭菌二氧化碳培养(美国 Thermo 公司);ELX-800 型酶标仪(美国 BioTek 公司);ARIA Ⅲ型流式细胞仪(美国 BD 公司);WD-9413B 凝胶成像分析系统(北京六一制造厂);DYY-7C 型蛋白电泳仪(北京六一制造厂)。

　　2.2 方法

　　2.2.1 “山慈菇-漏芦”醇提取物制备

　　称取山慈菇 12 g，漏芦 30 g，用粉碎机粉碎，加入 75%乙醇 500 mL，回流提取 3 次，均在沸后提取 1.5 h 左右，合并 3 次提取液，采用旋转蒸发仪将提取液浓缩成浸膏状，置于烘箱中 60 ℃烘干至粉末状，置于 4 ℃ 冰箱备用。实验开始前，首先将药物用 DMSO 进行溶解并震荡，配置成含生药质量浓度为 10 g·L-1 的母液， DMEM 培养基稀释为工作液，0.22 μm 滤膜除菌，备用。

　　2.2.2 MDA-MB-231 细胞培养

　　将人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞株置于 37 ℃，5% CO2 培养箱中，并使用 DMEM 高糖培养基(含 10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素)培养细胞，平均 1~2 d 进行 1 次换液，并取对数生长期细胞进行实验。

　　2.2.3 CCK-8 法检测细胞活性

　　取对数生长期的人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞消化，接种于 96 孔板，平均细胞数为 8×103 个/孔，设定实验分组，分别为空白组，DMSO 组，低剂量组(10 mg·L-1)，中剂量组(25 mg·L-1)，高剂量组(50 mg·L-1)，将低、中、高剂量组的“山慈菇-漏芦”醇提取物作用 MDA-MB-231 细胞 24 h，将培养液吸出后加入含 10%CCK-8 的培养基，2 h 后(避光孵育)，使用酶标仪在 450 nm 波长处检测各组吸光度 A 并计算，细胞活性= (A 加药细胞-A 空白)/(ADMSO-A 空白)×100%。

　　2.2.4 流式细胞仪检测细胞的凋亡率

　　取对数生长期的人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞消化，接种于 6 孔板中，细胞数目约 1×105 个/孔，设定实验分组，分别为空白组，DMSO 组，低、中、高剂量组，将低、中、高剂量组“山慈菇-漏芦”醇提取物作用 MDA-MB-231 细胞 24 h，收集细胞后，每组加入的 Binding-Buffer 悬浮液 500 μL，依次加入 Annexin V-FITC 5 μL，Propidium Iodide 5 μL 进行混匀，染色 15 min(室温避光)，于 1 h 内通过流式细胞仪检测，并分析细胞的凋亡率情况。

　　2.2.5 应用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测 PI3K，p-PI3K，Akt，P-Akt 蛋白的表达情况

　　取对数生长期的人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞消化，接种在 10.0 mm 直径的培养皿中，每皿中平均细胞数量为 2×106 个，设定实验分组，分别为空白组，DMSO 组，低、中、高剂量组，将低、中、高剂量“山慈菇-漏芦”醇提取物作用 MDA-MB-231 细胞 24 h 后收集细胞，加上 RIPA 裂解液裂解细胞(冰上操作)，离心，收集蛋白进行蛋白浓度测定;取等量总蛋白上样进行 15% SDS-PAGE，电泳条件为缓冲胶 110 V 电泳 30 min，分离胶 55 V 电泳 60 min，转膜条件为 PVDF 膜 55 mA 恒流湿转 120 min，封闭 60 min，PI3K，p-PI3K，Akt， P-Akt 一抗 4 ℃过夜孵育，次日滴加二抗避光室温孵育 1 h 后 TBST 洗膜，ECL 发光后进行图像采集及数据分析。

　　2.3 统计学方法

　　以上实验重复 3 次，实验数据采用 SPSS 22.0 进行统计学分析，数据???±s 表示，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 “山慈菇-漏芦”药物有效化学成分

　　本研究基于 OB≥30%，DL≥0.18 为筛选条件，从 TCMSP 数据库中共获取 7 个有效化学成分，山慈菇 3 个，漏芦为 5 个，其中 β-谷甾醇在两药中均含有。见表 1。

　　3.2 药物与乳腺癌相关靶点

　　利用 GeneCards 数据库筛选获得乳腺癌相关靶共 14 630 个，将“山慈菇-漏芦”的活性化合物对应的 61 个药物靶点与乳腺癌对应的 14 630 个疾病靶点获取交集，通过 Venn 图的形式得到 55 个共同靶点。

　　3.3 “药物-疾病”靶点网络构建与分析

　　将 7 个有效成分及 55 个共同靶点通过 Cytoscape 3.7.2 软件构建山慈菇-漏芦“药物-疾病”的可视化网络图。

　　3.4 药物与乳腺癌靶蛋白 PPI 网络的构建

　　从 Venn 图中获得 55 个药物-疾病共同靶点上传至 STRING 数据库进一步得到 PPI 网络。

　　3.5 “山慈菇-漏芦”治疗乳腺癌的通路富集分析

　　3.5.1 GO 通路富集分析

　　通过 GO 功能富集分析共获得 832 个条目，其中“山慈菇-漏芦”治疗乳腺癌的关键靶点基因信息功能主要涉及的生物过程有细胞对药物的反应(cellular response to drug)，膜电位的调节(regulation of membrane potential)，对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)，腺苷酸环化酶调节 G 蛋白偶联受体信号通路(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)等。

　　3.5.2 KEGG 通路富集分析

　　通过分析共富集到 KEGG 通路 85 条，筛选功能排名前 21 名条目，“山慈菇-漏芦”治疗乳腺癌的关键基因靶点所涉及到的信号通路主要有雌激素信号通路，p53 信号通路，血管内皮生长因子(VEGF)信号通路，磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信号通路，人表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂耐药通路，钙信号通路，乳腺癌等经典信号通路，见表 2。

　　3.5.3 “山慈菇-漏芦”醇提取物影响人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖情况

　　与空白组，DMSO 组细胞相比，低、中、高剂量的“山慈菇-漏芦”醇提取物作用于乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 24 h 后，3 组细胞活性显著降低(P<0.01)，见表 3。

　　3.5.4 “山慈菇-漏芦”醇提取物影响人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞凋亡情况

　　流式细胞仪检测结果显示，“山慈菇-漏芦”醇提取物作用 MDA-MB-231 细胞 24 h 后，与空白组，DMSO 组比较，低、中、高剂量组的细胞凋亡率均显著升高(P<0.01)。(表 4，图 6)

　　3.5.5 “山慈菇-漏芦”醇提取物对各组细胞中 p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 比值的影响

　　Western blot 实验的结果发现，“山慈菇-漏芦”醇提取物在作用 MDA-MB-231 细胞 24 h 后，通过与空白组， DMSO 组比较，低、中、高剂量组细胞中的 p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt 的比值均显著降低均明显降低(P<0.05)。见表 5，图 1。

　　4 讨论

　　我国女性恶性肿瘤当中发病率最高的是乳腺癌，并且患者的死亡率也是逐年增加[9]。而在乳腺癌的分型当中，三阴型乳腺癌的死亡率占比最高，并且易复发转移，在临床治疗中也是最棘手的，激素以及靶向治疗对三阴性乳腺癌的效果均不显著，几乎只能通过化疗进行诊治[10]。此外，中医讲痰浊、热毒等病理产物进行相互搏结而产生“癌毒”之邪，它可以是此类型乳腺癌的病因之一，可以采用清解癌毒、通络化痰散结的治疗方法进行治疗。

　　有研究表明山慈菇、漏芦治疗乳腺癌可以取得很好的疗效[11]，山慈菇性甘、凉、微辛，归肝、脾经，具有清热解毒，消痈散结之功，有实验研究表明[12-13]，山慈菇提取液可以明显抑制人乳腺癌 MDA?MB?231 细胞的增殖，还诱导其细胞的凋亡，作用机制可能是抑制了 PI3K/Akt 信号通路的活化;山慈菇水煎剂也可以明显抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖，诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的迁移。漏芦苦寒，归胃经，有清热解毒、消痈散结、通经下乳、舒筋通脉的功效，有研究发现[14]，大剂量的漏芦提取物可以发挥显著的抑癌作用。因此两药配伍，具有明显的清热解毒、散结抗癌之功，是治疗乳岩的要药。

　　本研究结果发现，山慈菇、漏芦治疗乳腺癌中的有效化学成分主要有 β-谷甾醇，豆甾醇，2-甲氧基-9， 10-二氢菲-4、5-二醇，DFV，谷甾醇，甘草苷和地黄素 B。有研究报道显示[15-16]，β-谷甾醇对肺癌、乳腺癌等有显著作用，可以通过多种途径发挥作用，比如细胞增殖、凋亡、周期、侵袭血管生成等。豆甾醇是一种生物活性高的天然提取物，生理功能较多，可以从抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、阻滞肿瘤细胞周期、破坏肿瘤血管生成、抑制癌细胞转移等多种途径发挥对肝癌、胃癌、胆管癌的抑癌作用 [17-19]。研究结果显示了山慈菇，漏芦两药中含有的相同或不同的化合物均具有显著的抑癌作用，因此两药联合应用可以得到更加显著的抑癌效果。

　　通过 PPI 蛋白互作结果可以看出，经筛选得到的主要靶点有 GSK3B，ESR1，CASP8 以及 MAPK14 等。 ESR1(estrogen receptor 1)为编码 ERα 的基因，该基因若出现突变，常会导致乳腺癌内分泌治疗的耐药，因此对该基因的监测对乳腺癌治疗以及预后会发挥很大的作用[20]。GSK3B(Glycogen synthase kinase-3 beta)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以通过作用信号蛋白结构蛋白以及转录因子来调控细胞的增殖、分化以及凋亡等。有研究发表明[21]，GSK3B 的表达情况影响着胃癌预后的情况。半胱氨酸蛋白酶 CASP8 是一种促凋亡蛋白，参与外源性凋亡信号通路，因此，其作为一种抑癌基因，参与了诸多肿瘤的发病过程，比如肝癌[22-23]、前列腺癌[24]等。MAPK14 作为 MAPK 亚家族成员之一，通过影响肿瘤细胞的凋亡与周期等生物学特性来影响肿瘤的发生发展，CHEN[25]等研究表明通过 MAPK14 来抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞的转移。由此可见，以上基因都参与着肿瘤的发生发展过程，并影响肿瘤的预后。

　　本研究通过 GO 富集分析结果发现，“山慈菇-漏芦”抗乳腺癌的靶基因主要是通过影响细胞对药物的反应、膜电位的调节、对类固醇激素的反应、腺苷酸环化酶调节 G 蛋白偶联受体信号通路等生物学功能而达到抗乳腺癌的目的。在本研究 KEGG 富集分析的结果中发现，“山慈菇-漏芦”主要是通过雌激素信号通路， p53 信号通路，PI3K-Akt 信号通路等发挥抗乳腺癌的作用。雌激素信号通路可以与一些蛋白互作，可能会同 TGF-β，MAPK，Akt，NF-κB 等信号传导途径交互，最终对乳腺肿瘤细胞的增殖、转移等具有影响[26]。p53 是一种抑癌基因，当细胞癌变时，上游功能的相关基因来抑制体内 p53 的表达，进而抑制细胞周期阻滞以及凋亡。在恶性肿瘤的发生发展中，PI3K/Akt 信号通路发挥着重要作用，有研究结果发现 PI3K/Akt 信号通路对恶性肿瘤的侵袭和转移等方面具有重要调控作用[27-28]，本研究选择此信号通路进行实验验证，发现“山慈菇 -漏芦”醇提取物可能是通过抑制 PI3K/Akt 信号通路的激活对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖起到抑制作用并促进其细胞的凋亡。

　　本研究最后对网络药理学所分析的结果进行了体外实验验证，通过“山慈菇-漏芦”醇提取物对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的增殖、凋亡以及对 PI3K/Akt 信号通路的调控作用进行实验研究。实验结果发现“山慈菇 -漏芦”醇提取物可以对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的增殖有抑制作用，并且可以诱导人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的凋亡，通过抑制 PI3K/Akt 信号通路活化进而控制乳腺癌发展。

　　综上可见，“山慈菇-漏芦”对乳腺癌细胞的抑制效果有显著优势，本实验基于网络药理学的研究，发现“山慈菇-漏芦”对乳腺癌的部分作用靶点以及具体作用机制，为中医药抗乳腺癌多靶点、多途径以及作用机制相关的研究提供了方法学借鉴，并为治疗乳腺癌的临床研究提供了理论支持和研究思路。

　　利益冲突：本文不存在任何利益冲突。