臭氧水对小鼠急性毒性和蓄积毒性试验

　　摘 要：用昆明种小白鼠作为实验动物分别进行急性毒性试验和蓄积毒性试验，来评价臭氧水的毒性。急性毒性试验采用最大给药法，试验组取浓度≥20mg/kg的臭氧水按20g/kg体质量限量，一次灌胃，观察14d内小鼠的死亡情况，计算半数致死量(MedianLethalDose，LD50)。蓄积毒性试验采用剂量递增法，按体质量计算染毒剂量。处理后1～4d小鼠染毒剂量为0.1倍的LD50，按20g/kg体质量，一次灌胃给药，以后每4d递增1.5倍剂量，直至20d。每4d对所有小鼠进行称重，统计增重和采食量，并测定小鼠器官指数，观察胃组织切片。结果表明：试验期间无小鼠死亡，臭氧水对小鼠的经口 LD50为20g/kg体质量，根据急性毒性分级，属实际无毒物质。臭氧水的蓄积系数 K>5。与灌注纯净水的对照组小鼠相比，灌注臭氧水对小鼠无任何不良影响。

　　关键词：昆明小白鼠;臭氧水;急性毒性试验;蓄积毒性试验

　　王群; 尹春庆; 刘艺丹; 王利华; 王光 青岛农业大学学报(自然科学版) 2021-12-13

　　臭氧作为一种高效广谱类的抗菌剂，其抑菌作用机理是氧化破坏微生物细胞中的重要组成部分，如细胞壁、细胞膜、线粒体与细胞核等[1]。含有臭氧的水溶液叫做臭氧水，在水中臭氧的半衰期为 20min[2]。臭氧水具有较高的杀菌性能，但是臭氧稳定性差、易分解为氧气，所以使用臭氧水杀菌时应尽量使用流动臭氧水，能解决臭氧半衰期短、易挥发的问题，从而提高臭氧的利用率[3]。臭氧在水中能形成羟自由基，仍具有较强的氧化性[4]。肖彩雯等[5]研究 表 明，用 4 mg/L 的 臭 氧 水 对 串 珠 菌 作 用 1min，杀菌率为99.86 %，对烟曲菌作用5min，杀菌率为99.57 %。与臭氧气体相比，臭氧水应用于养殖场更为便捷，不仅可用于环境消毒，也可对畜禽饮水进行消毒。如果用于饮用水消毒，臭氧会残留在水中被畜禽摄入体内。为了评价高浓度的臭氧水在畜牧生产上的安全性，本试验以昆明小白鼠为实验动物，采用最大给药法经口灌胃进行臭氧水急性毒性试验，采用剂量递增法进行臭氧水的蓄积毒性试验，以确 定 臭 氧 水 的 半 数 致 死 量 (Median LethalDose，LD50)和蓄积系数 K。

　　1 材料与方法1.1 试验材料与实验动物

　　臭氧水由青岛欧帝欧环保科技发展有限公司生产并提供机器现场制得，经在线式溶解臭氧浓度检测仪(CL7685，淄博爱迪尔测控技术有限 公 司)分析，臭氧浓度为≥20mg/kg。实验动物为无特定病原体(SpecificpathogenFree，SPF)级昆明 种 小 白鼠，购于青岛市即墨区实验动物和动物实验中心，生产许可号为scxk(鲁)20040001。体质量18～22g，雌雄各半，试验期内自由采食、自由饮水(蒸馏水)，采用自然光照，室温26～30℃。鼠粮购自北京科澳协力饲料有限公司，为专用全价日粮。

　　1.2 试验方法

　　臭氧水的急性毒性试验采用最大给药法。取小鼠20只(雌雄各半)为试验组，灌注臭氧水前小鼠禁食约12h，不禁水。试验组取浓度为≥20mg/kg的臭氧水按20g/kg体质量限量，一次灌胃，灌胃后禁食约2h后再正常喂食;另取10 只小鼠(雌、雄各半)用纯净水替代臭氧水做对照组。观察时间为14d，观察记录小鼠的行为活动、精神状态、采食饮水以及中毒和死亡情况。在半数致死量的测定结果基础上，选用体质量为18～22g昆明种小鼠30只，雌、雄各半。其中20只小鼠采用剂量递增法进行臭氧水的蓄积毒性试验，按体质量计算染毒剂量。第1～4天小鼠染毒剂量为0.1LD50，按20g/kg体质量一次灌胃给药，以后每4d递增1.5倍剂量，直至20d，染毒方案见表1;另取10只小鼠(雌、雄各半)每天按20g/kg体质量灌注纯净水以确定灌注对小鼠的影响。连续染毒20d后，若动物死亡未达半数，染毒累积剂量已达一次 LD50的5.3倍，即蓄积系数大于5.0，试验即可结束;若试验期间动物发生半数死亡，则可按表1查得相应的染毒累积剂量，并计算累积系数，按累积系数的评价标准评价蓄积毒性。

　　1.3 检测指标

　　在急性毒性试验中，观察小鼠中毒症状及出现时间，根据小鼠死亡情况计算半数致死量 LD50。在蓄积毒性试验中，确定蓄积系数 K。每4d对所有小鼠进行称重，统计增重和采食量，试验结束后即第21天对小鼠进行屠宰实验，对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行称重，并计算相应的器官指数(器官指数为实验动物某器官质量与其体质量之比)。取小鼠胃组织相同的部位2cm，用生理盐水清洗后放入10mL/L 甲醛溶液中进行固定。将已固定好的胃组织经修整、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤后，用苏木精-伊红(HE)进行染色，制成胃组织切片。采用光学显微镜(ae-2000，Nikon，日本)观察切片。

　　1.4 数据统计分析

　　应用 Excel2007，对数据进行整理与分析，小鼠的体质量、器官指数采用SAS9.4软件中的 MIXED过程进行方差分析，分析臭氧水、性别两个主效应及二者的互作效应对小鼠生产性能和器官指数的影响，计算最小二乘均数及 标 准 误，检 验 误 差 为 5%水平。

　　2 结果与分析2.1 臭氧水的半数致死量

　　在试验进行的14d内，试验组的小鼠未出现中毒症状，观察期间无小鼠死亡，试验结果见表2。由此可判定臭氧水对小鼠一次经口 LD50为 20g/kg体质量，根据 GB15193.3—2014急性毒性剂量分级表，属实际无毒物质。

　　2.2 臭氧水的蓄积系数

　　试验观察期间小鼠连续染毒已达到20d，此时染毒的总剂量已累计达到5倍的 LD50以上，小鼠无中毒症状和死亡现象，表明臭氧水的蓄积毒性不明显，因此中止试验。根据蓄积系数分级，判定臭氧水对小鼠蓄积系数 K>5，为弱蓄积性。

　　2.3 臭氧水灌注对小鼠生长性能的影响

　　试验 组 与 对 照 组 小 鼠 的 体 质 量 无 显 著 差 异(P>0.05)，故臭氧水灌注处理对小鼠的体质量没有显著影响(P>0.05)。性别对小鼠体质量影响显著(P<0.05)。第1天时，雄鼠与雌鼠的体质量差异不显著，从第5天开始，雄鼠的体质量均显著高于雌鼠(P<0.05)。

　　由图1可以看出，雄鼠的采食高于雌鼠，与对照组相比，试验组小鼠的采食量有降低的趋势。

　　2.4 臭氧水灌注对小鼠器官指数的影响

　　小鼠的内脏器官指数见表4。试验组小鼠的心脏、肝脏、肺脏和肾脏均未见异常，各器官指数均表现为对照组与试验组差异不显著(P>0.05)。性别对小鼠的体质量、脾脏指数和肾脏指数的影响显著(P<0.05)，雄 鼠 的 体 质 量 显 著 高 于 雌 鼠 (P <0.05)，脾脏指数显著低于雌鼠(P<0.05)，肾脏指数显著高于雌鼠(P<0.05)。灌注臭氧水与性别间的互作效应不显著(P>0.05)。

　　2.5 臭氧水灌注对小鼠组织学检查的影响

　　对照组和试验组的小鼠胃组织切片镜检结果分别见图2和图3。检查结果表明，试验组小鼠的胃的黏膜完整，未见有组织学损伤。

　　3 讨论3.1 臭氧水半数致死量和蓄积系数

　　臭氧已广泛用于饮用水的消毒，臭氧水具有强氧化性和抑菌杀菌能力[6]。赵永强等[7]发现经4.5mg/L浓 度 的 臭 氧 水 处 理30min后 的 罗 非 鱼 片 对SD大鼠经口最大耐受剂量(MTD)>15g/kg，毒性分级为无毒。张敏等[8]对含16mg/L的臭氧消毒水进行毒性试验，结果表明16mg/L臭氧消毒剂为实际无毒、弱蓄积性物质，对小鼠骨髓 PCE 亦无诱变作用，对动物皮肤、眼睛和阴道黏膜均无刺激性，使用安全。本试验制得的臭氧水经在线分析系统分析在20mg/L以上，对小鼠的急性毒性试验和蓄积毒性试验均未发现小白鼠有中毒症状，可以进一步证实臭氧水为实际无毒物质，具有弱蓄积性。

　　3.2 臭氧水对小鼠生长性能的影响

　　小鼠存在藏料行为，采食量虽然不能真实反映小鼠食入的饲料量，但与小鼠的生长呈正相关。小鼠的生长性能可以间接反映小鼠的生理状况，理想的生长性能在一定程度上可以说明身体的机能良好。郑 云 燕 等[9] 研 究 结 果 显 示，10.35～10.95mg/L的臭氧水对大鼠急性经口毒性属实际无毒类，大鼠亚急性毒性试验各组动物生长发育良好，体质量增加正常。袁安生等[10]证明，通过臭氧处理饮用水和饲料等的试验组比没有处理的对照组的雏鸡存活率、饲料利用率以及出栏体质量都有显著的提高。沈林園等[11]研究发现通过臭氧水处理饮用水后饲喂的鸡，发病现象明显减少，药物投入减少，死淘率降低，提高了经济效益。本试验通过小鼠的体质量和采食量也可以证明灌注臭氧水对小鼠无不良影响。但若想用臭氧水作为畜禽的饮用水以此替代抗生素的 作 用 还 需 要 在 畜 禽 生 产 上 进 行 试 验 加 以验证。

　　3.3 臭氧水对小鼠器官指数的影响

　　内脏器官指数可以初步作为评定内脏器官是否受到损伤的指标。当内脏器官受到损伤会发生炎性反应、坏死或出现水肿，最终表现在重量发生变化。免疫抑制剂可使脾脏重量减轻，一般免疫药理学试验常以脾脏的增重或减重作为衡量其免疫功能强弱的指标[12]。肾是机体重要的解毒器官，肾功能将直接影响机体解毒机能，岳丽红等[13]的试验数据为青年组昆明 小 鼠 (体 质 量 为 31.17g)的 肾 脏 指 数 为15.28，而衰老组的肾脏指数为16.64。由此可以推断，本试验中臭氧水灌注组的小鼠的肾脏较纯净水灌注组更为健康。张永东等[14]从酶学水平研究了臭氧对肉鸡的肺毒性，结果显示各臭氧处理组对肺脏均无明显损伤。本试验结果表明纯净水灌注组小鼠的内脏器官指数与臭氧水灌注组之间没有显著差异，说明 臭 氧 水 灌 注 对 小 鼠 无 不 良 影 响。李 玉 冰等[15]试验发现，臭氧处理30min、60min、120min，在第 30 天和第 60 天采样小鼠的脏器系数与对照组比 较 无 显 著 性 差 异。这 与 本 试 验 研 究 结 果 相一致。

　　3.4 臭氧水对小鼠组织学检查的影响

　　在本试验中，未见臭氧水对小鼠的胃造成损伤。这从组织学上进一步证实臭氧水的低毒性。而且臭氧作为一个强大的氧化剂，会立即与胃中大量的离子和生物分子即抗氧化剂、蛋白质、碳水化合物以及多不饱和脂肪酸结合白蛋白反应，从而降低臭氧的含量，同时也会减少臭氧的毒性。

　　4 结论

　　臭氧水对小鼠经口 LD50为20g/kg体质量，根据急性毒性分级，属实际无毒物质;臭氧水对小鼠蓄积系数 K>5，为弱蓄积性;与纯净水灌注组的小鼠相比，臭氧水灌注对小鼠无任何不良影响。